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    本發明係有關於一種蝴蝶蘭品種之鑑定方法及鑑定套組，其中蝴蝶蘭品種之鑑定套組，包括：至少一微衛星引子對，其中每一微衛星引子對係包括：一與SEQ ID NOs: 1-72之所示序列具有75-100%一致性之核苷酸。
    公开号:TW201309804A
    申请号:TW100130368
    申请日:2011-08-24
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Wen-Luan Wu；Yi-Tzu Kuo；Yu-Ling Lee；Yu-Lin Chung
    申请人:Univ Nat Cheng Kung；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    蝴蝶蘭品種之鑑定方法及鑑定套組
    本發明係關於一種蝴蝶蘭品種之鑑定方法及鑑定套組，尤指一種以微衛星分子標記鑑定蝴蝶蘭品種之鑑定方法及鑑定套組。
    蝴蝶蘭為台灣最大宗的外銷花卉，其2009年出口值約20億元，佔蘭花總出口值之78%，且更佔台灣外銷花卉總金額之58%。截至目前為止，台灣掌握全球最多蝴蝶蘭品種，且種苗栽培技術領先全球。因此，蝴蝶蘭為台灣花卉中最重要的經濟栽培作物，可供商業瓶苗、蘭苗、盆花及切花之生產，具有可觀的經濟利益
    由於蝴蝶蘭品種眾多，故須對既有品種、稀有品種、甚至是新品種之蝴蝶蘭品種進行鑑定，以判斷蝴蝶蘭品種及其經濟價值。傳統蝴蝶蘭品種鑑定主要以植株及花色、花紋等花部外表形態做為品種鑑定之依據；但以傳統方式鑑定蝴蝶蘭時，往往面臨蝴蝶蘭的花形與花色變異很大、且形態特徵易受環境因素與植物發育時期影響的問題。同時，不僅同一品種內存在著差異，不同品種間亦有外型相似的情形，而造成鑑定結果有所誤差。此外，蝴蝶蘭由蘭苗至開花歷時較長，傳統鑑定方法難以應用於幼苗時期之鑑別，故往往需一至三年後始可進行蝴蝶蘭品種之鑑定。
    因此，目前急需發展出一種蝴蝶蘭品種之鑑定方法及鑑定套組，以期可早期且快速的鑑定出蝴蝶蘭之品種，以減少品種遭受侵權盜用之情形，維護育種者的權益。
    本發明之主要目的係在提供一種蝴蝶蘭品種之鑑定套組，俾能用以鑑定蝴蝶蘭之品種。
    本發明之另一目的係在提供一種蝴蝶蘭品種之鑑定方法，俾能快速且早期的鑑定出蝴蝶蘭之品種。
    為達成上述目的，本發明之蝴蝶蘭品種之鑑定套組，包括：至少一微衛星引子對，其中每一微衛星引子對係包括：一與選自由下列群組之引子對之所示序列具有75-100%一致性之核苷酸：一包括如SEQ ID NO: 1、及SEQ ID NO: 2所示序列之第一引子對；一包括如SEQ ID NO: 3、及SEQ ID NO: 4所示序列之第二引子對；一包括如SEQ ID NO: 5、及SEQ ID NO: 6所示序列之第三引子對；一包括如SEQ ID NO: 7、及SEQ ID NO: 8所示序列之第四引子對；一包括如SEQ ID NO: 9、及SEQ ID NO: 10所示序列之第五引子對；一包括如SEQ ID NO: 11、及SEQ ID NO: 12所示序列之第六引子對；一包括如SEQ ID NO: 13、及SEQ ID NO: 14所示序列之第七引子對；一包括如SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16所示序列之第八引子對；一包括如SEQ ID NO: 17、及SEQ ID NO: 18所示序列之第九引子對；一包括如SEQ ID NO: 19、及SEQ ID NO: 20所示序列之第十引子對；一包括如SEQ ID NO: 21、及SEQ ID NO: 22所示序列之第十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 23、及SEQ ID NO: 24所示序列之第十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 25、及SEQ ID NO: 26所示序列之第十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 27、及SEQ ID NO: 28所示序列之第十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 29、及SEQ ID NO: 30所示序列之第十五引子對；一包括如SEQ ID NO: 31、及SEQ ID NO: 32所示序列之第十六引子對；一包括如SEQ ID NO: 33、及SEQ ID NO: 34所示序列之第十七引子對；一包括如SEQ ID NO: 35、及SEQ ID NO: 36所示序列之第十八引子對；一包括如SEQ ID NO: 37、及SEQ ID NO: 38所示序列之第十九引子對；一包括如SEQ ID NO: 39、及SEQ ID NO: 40所示序列之第二十引子對；一包括如SEQ ID NO: 41、及SEQ ID NO: 42所示序列之第二十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 43、及SEQ ID NO: 44所示序列之第二十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 45、及SEQ ID NO: 46所示序列之第二十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 47、及SEQ ID NO: 48所示序列之第二十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 49、及SEQ ID NO: 50所示序列之第二十五引子對；一包括如SEQ ID NO: 51、及SEQ ID NO: 52所示序列之第二十六引子對；一包括如SEQ ID NO: 53、及SEQ ID NO: 54所示序列之第二十七引子對；一包括如SEQ ID NO: 55、及SEQ ID NO: 56所示序列之第二十八引子對；一包括如SEQ ID NO: 57、及SEQ ID NO: 58所示序列之第二十九引子對；一包括如SEQ ID NO: 59、及SEQ ID NO: 60所示序列之第三十引子對；一包括如SEQ ID NO: 61、及SEQ ID NO: 62所示序列之第三十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 63、及SEQ ID NO: 64所示序列之第三十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 65、及SEQ ID NO: 66所示序列之第三十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 67、及SEQ ID NO: 68所示序列之第三十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 69、及SEQ ID NO: 70所示序列之第三十五引子對；以及一包括如SEQ ID NO: 71、及SEQ ID NO: 72所示序列之第三十六引子對。
    此外，本發明更提供一種以上述蝴蝶蘭鑑定套組之蝴蝶蘭品種鑑定方法，包括下列步驟：(A)提供一待檢測蝴蝶蘭之組織樣品，並萃取組織樣品中之基因組DNA；(B)上述之至少一微衛星引子對檢測組織樣品中之基因組DNA，以取得待檢測蝴蝶蘭之基因型；以及(C)將所取得之待檢測蝴蝶蘭之基因型與一已知之蝴蝶蘭基因型資料庫比對，以鑑定出待檢測蝴蝶蘭之品種。
    於本發明之蝴蝶蘭品種鑑定套組及鑑定方法中，係透過蝴蝶蘭之微衛星序列，而僅需少量植物組織萃取基因組DNA，即可快速的鑑定出蝴蝶蘭之品種。相較於使用擴增片段長度多型性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、隨機擴增片段多型性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、限制酵素片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)等技術之DNA分子標誌，微衛星序列有操作相對快速簡易(僅需3至7天檢測時間)、高度多型性、結果再現性高且適用於自動化高通量分析等優點。此外，本發明之蝴蝶蘭品種鑑定套組及鑑定方法，更不受植物生長環境與時期影響，可用於未開花株、小苗或瓶苗檢測上，而早期鑑定出蝴蝶蘭之品種。再者，本發明所提供之蝴蝶蘭品種鑑定套組及鑑定方法，更可用以賦予每個蝴蝶蘭栽培品種一個獨特的DNA分子條碼，以提升蝴蝶蘭品種鑑定的速度與精確度。
    於本發明之蝴蝶蘭品種之鑑定方法及鑑定套組中，較佳為，每一微衛星引子對係為一套引子對序列，此引子對序列係包括任一選自由第一引子對至第三十六引子對所組成之群組之核苷酸序列。此外，於此些引子對中，其序列之5'端或3'端，可更添加數個(1至15個不等)之核苷酸；更佳為，每一微衛星引子對即為一套引子對序列，其係選自由：第一引子對至第三十六引子對所組成之群組。
    此外，於本發明之蝴蝶蘭品種之鑑定方法及鑑定套組中，至少一微衛星引子對可包括一微衛星正向引子、以及一微衛星反向引子。其中，較佳為微衛星正向引子或反向引子之任一引子之5'端係標定有一螢光試劑，經螢光試劑標定之引子對，經聚合酶鏈鎖反應(PCR)擴增後所得之產物，得以透過DNA分析儀鑑定蝴蝶蘭品種基因型。更佳為，不同微衛星引子對標定不同螢光試劑，經不同螢光試劑標定之引子對，並將透過聚合酶鏈鎖反應(PCR)擴增所得之產物混合於同一管中進行基因型鑑定。。正向引子或反向引子所連接之螢光試劑可為本技術領域常用之DNA標定用螢光試劑，如HEX、FAM、及NED。
    再者，於本發明之蝴蝶蘭品種之鑑定方法中，於步驟(B)中可透過本技術領域常用之DNA分析技術分析組織樣品中之基因組DNA；較佳為，係透過聚合酶鏈鎖反應(PCR)以至少一微衛星引子對檢測組織樣品中之基因組DNA。此外，於步驟(B)中可透過檢測擴增片段大小以鑑別蝴蝶蘭品種。 萃取蝴蝶蘭組織樣品中之基因組DNA
    蒐集欲鑑定基因型之蝴蝶蘭栽培品種根、莖、葉或花部組織，加入液態氮研磨或以組織磨碎器將組織磨碎至粉末狀，以本技術領域已知之CTAB方法(十六烷基三乙基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide))或植物基因組DNA萃取套組，微量萃取基因組DNA，並稀釋至濃度3 ng/μL儲存於-20℃備用。
    於本實施例中，係蒐集51種(如下表2所示)已於台灣申請或取得植物品種權蝴蝶蘭栽培品種約0.2克蝴蝶蘭栽培品種葉片組織，以液態氮研磨至粉末狀，以植物基因組DNA萃取套組(BioKit Plant Genomic DNA Purification Kit(BioKit Biotechnology Incorporation)、或QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(QIAGENE))萃取基因組DNA，並稀釋至濃度3 ng/μL儲存於-20℃備用。 聚合酶鏈鎖反應分析基因組DNA
    首先，取5.0 μL濃度為3 ng/μL之蝴蝶蘭組織樣品之基因組DNA，並加入2.5 μL之10× PCR緩衝溶液(VIOGENE,富聯生物科技股份有限公司)、2.5 μL之1% Tween 20、1.0 μL之2.5 mM dNTP、1.0 μL之5 μmol之標定有螢光試劑之微衛星正向引子(如下表1所示)、1.0 μL之5 μmol之微衛星反向引子(其未標定有螢光試劑，如下表1所示)、0.2 μL之5 U之DNA聚合酶(PureTag DNA polymerase,VIOGENE)，再加入無菌水至總體積25 μL，而後進行PCR擴增反應。其中，PCR擴增反應條件如下：首先，於94℃反應5分鐘；重複40個迴圈，每個迴圈設計為94℃反應30秒；於煉合溫度下(如下表1所示)反應30秒；72℃反應40秒；最後在72℃下反應5分鐘，停止反應溫度為4℃。

    而後，以2-3%瓊脂凝膠進行電泳分析，確認微衛星引子對進行PCR擴增產物的有無。而後，將標定不同螢光試劑之PCR擴增產物混合，送至生物科技公司以DNA分析儀進行蝴蝶蘭品種微衛星分子標誌基因型鑑定。最後，利用Peak Scanner或GeneMapper軟體讀取基因型鑑定結果，分析蝴蝶蘭品種基因型。
    於本實施例中，係使用19組微衛星引子對(如下表3所示)進行分析，並針對51種(如下表2所示)蝴蝶蘭品種進行PCR擴增反應；再以3%瓊脂凝膠進行電泳分析，確認在預期大小(如上表1所示)範圍PCR擴增產物有無。接著，將二至三種標定不同螢光試劑之PCR擴增產物混合在同一管中，送至生物技術公司，以DNA分析儀(ABI PRISM 3730 DNA analyzer)鑑定51個蝴蝶欄栽培品種於19組微衛星引子對之基因型。其中，以第一引子對及第九引子對分析Dtps. Taida Firebird ‘Taida Red Rose’台大紅玫瑰之結果、及以第十引子對及第十四引子對分析Dtps. Sogo Meili ‘SOGO F1751’世芥F1751之DNA分析儀分析結果係如圖1所示。
    而後，以Peak Scanner軟體讀取基因型鑑定結果，紀錄各蝴蝶蘭栽培品種於19組微衛星引子對分析所得之基因型(如下表2所示，其中僅列出第一引子對、第二引子對、及第三引子對之基因型分析結果)；並依據蝴蝶蘭栽培品種對偶基因的有無，以0代表無特定對偶基因，以1代表有特定對偶基因後，再利用NYSYS軟體分析品種相似度分析，結果係顯示於圖2中，其中圖中數字1-51代表51個蝴蝶蘭栽培品種編號。如圖2結果顯示，19組微衛星分子標誌基因型鑑定結果，可鑑別51個已於台灣申請或取得植物品種權之蝴蝶蘭栽培品種。此結果顯示本發明所開發螢光標定微衛星分子標誌可成功鑑別蝴蝶蘭栽培品種。


    aN：表示微衛星引子對於蝴蝶蘭栽培品種無PCR擴增產物
    此外，根據基因型鑑定結果，分析各微衛星引子對於51蝴蝶蘭栽培品種所得對偶基因(allele)數與對偶基因出現頻率，計算代表微衛星分子標誌鑑別力的PIC值，此19組微衛星分子標誌PIC值介於0.62(第三引子對)至0.95(第二十三引子對)之間。統計相異獨特基因型(unique genotype)數目，其中微衛星分子標誌第七引子對在51品種中可偵測得49個相異獨特基因型，顯示第七引子對一組微衛星引子對即可鑑別其中49個品種(如下表3所示)。顯示本技術所開發微衛星分子標誌於蝴蝶蘭栽培品種的鑑別，具有相當高的鑑別力。

    a相異基因型數與對偶基因數：表示微衛星引子對於本實施例之51個蝴蝶蘭栽培品種中，所偵測到的基因型數目與對偶基因數目。
    bPIC值：PIC(polymorphism Information Content)，可表示一組微衛星引子對鑑別力程度，數值越大，鑑別力越高。
    由上述表1至表3、及圖1至圖2之結果顯示，本發明所提供之微衛星引子對具有極佳之鑑別力，且僅需少數組螢光標定微衛星引子對即可鑑別上述蝴蝶蘭品種。此外，更無須等蝴蝶蘭開花即可進行品種鑑定，故除了可提升蝴蝶蘭品種鑑定的精確度外，更可提供未開花幼苗早期鑑定。
    另一方面，本發明所提供之蝴蝶蘭品種之鑑定套組，其微衛星引子對更可用以賦予每個蝴蝶蘭栽培品種一個獨特的DNA分子條碼，建立DNA資料庫，以減少品種遭受侵權盜用之可能性。
    在此，係使用本發明之微衛星引子對(第一引子對、第二引子對、第三引子對、第四引子對、第七引子對、第十六引子對、第十九引子對)，對數種蝴蝶蘭品種進行分析以得到之蝴蝶蘭基因型DNA分子條碼之例子。結果係如下表4所示。
    例如，當使用第一引子對作為微衛星引子對進行分析時，可以英文字母G代表基因型(320,337)；當使用第二引子對作為微衛星引子對進行分析時，可以英文字母D代表基因型(177)，G代表(164,190)。亦即，於每一引子對分析中，不同的基因型係賦予不同的英文字母；且每一引子對分析結果係分別對應於一英文字母。於本實施例中，以七組微衛星引子對鑑定，可產生一由七個字母所組成之特殊DNA分子條碼。例如，中營恩典在七組微衛星分子標誌鑑定結果可產生一特殊DNA分子條碼QGFJPQG，北極光為GMLAGKG。
    使用越多組微衛星引子對進行分析，則可得到相對應數目之英文字母所組成之特殊DNA分子條碼。藉由此特殊之DNA分子條碼，可建立出一蝴蝶蘭DNA品種資料庫，以減少品種遭受侵權盜用之情形，維護育種者的權益。
    上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
    圖1係本發明一較佳實施例之台大紅玫瑰及世芥F1751之DNA分析儀分析結果圖。
    圖2係本發明一較佳實施例之微衛星引子對鑑定蝴蝶蘭品種之相似性群集分析結果圖。
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    权利要求:
    Claims (17)
    [1] 一種蝴蝶蘭品種之鑑定套組，包括：至少一微衛星引子對，其中每一該微衛星引子對係包括：一與選自由下列群組之引子對之所示序列具有75-100%一致性之核苷酸：一包括如SEQ ID NO: 1、及SEQ ID NO: 2所示序列之第一引子對；一包括如SEQ ID NO: 3、及SEQ ID NO: 4所示序列之第二引子對；一包括如SEQ ID NO: 5、及SEQ ID NO: 6所示序列之第三引子對；一包括如SEQ ID NO: 7、及SEQ ID NO: 8所示序列之第四引子對；一包括如SEQ ID NO: 9、及SEQ ID NO: 10所示序列之第五引子對；一包括如SEQ ID NO: 11、及SEQ ID NO: 12所示序列之第六引子對；一包括如SEQ ID NO: 13、及SEQ ID NO: 14所示序列之第七引子對；一包括如SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16所示序列之第八引子對；一包括如SEQ ID NO: 17、及SEQ ID NO: 18所示序列之第九引子對；一包括如SEQ ID NO: 19、及SEQ ID NO: 20所示序列之第十引子對；一包括如SEQ ID NO: 21、及SEQ ID NO: 22所示序列之第十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 23、及SEQ ID NO: 24所示序列之第十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 25、及SEQ ID NO: 26所示序列之第十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 27、及SEQ ID NO: 28所示序列之第十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 29、及SEQ ID NO: 30所示序列之第十五引子對；一包括如SEQ ID NO: 31、及SEQ ID NO: 32所示序列之第十六引子對；一包括如SEQ ID NO: 33、及SEQ ID NO: 34所示序列之第十七引子對；一包括如SEQ ID NO: 35、及SEQ ID NO: 36所示序列之第十八引子對；一包括如SEQ ID NO: 37、及SEQ ID NO: 38所示序列之第十九引子對；一包括如SEQ ID NO: 39、及SEQ ID NO: 40所示序列之第二十引子對；一包括如SEQ ID NO: 41、及SEQ ID NO: 42所示序列之第二十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 43、及SEQ ID NO: 44所示序列之第二十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 45、及SEQ ID NO: 46所示序列之第二十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 47、及SEQ ID NO: 48所示序列之第二十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 49、及SEQ ID NO: 50所示序列之第二十五引子對；一包括如SEQ ID NO: 51、及SEQ ID NO: 52所示序列之第二十六引子對；一包括如SEQ ID NO: 53、及SEQ ID NO: 54所示序列之第二十七引子對；一包括如SEQ ID NO: 55、及SEQ ID NO: 56所示序列之第二十八引子對；一包括如SEQ ID NO: 57、及SEQ ID NO: 58所示序列之第二十九引子對；一包括如SEQ ID NO: 59、及SEQ ID NO: 60所示序列之第三十引子對；一包括如SEQ ID NO: 61、及SEQ ID NO: 62所示序列之第三十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 63、及SEQ ID NO: 64所示序列之第三十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 65、及SEQ ID NO: 66所示序列之第三十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 67、及SEQ ID NO: 68所示序列之第三十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 69、及SEQ ID NO: 70所示序列之第三十五引子對；以及一包括如SEQ ID NO: 71、及SEQ ID NO: 72所示序列之第三十六引子對。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之鑑定套組，其中每一該微衛星引子對為一套引子對序列，該引子對序列係包括：任一選自由該第一引子對至該第三十六引子對所組成之群組之核苷酸序列。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之鑑定套組，其中每一該微衛星引子對為一套引子對序列，該引子對序列係選自由：該第一引子對至該第三十六引子對所組成之群組。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之鑑定套組，其中該至少一微衛星引子對係包括一微衛星正向引子、以及一微衛星反向引子。
    [5] 如申請專利範圍第4項所述之鑑定套組，其中該微衛星正向引子之5端係連接有一螢光試劑。
    [6] 如申請專利範圍第5項所述之鑑定套組，其中該螢光試劑係為HEX、FAM、或NED。
    [7] 如申請專利範圍第4項所述之鑑定套組，其中該微衛星反向引子之5端係連接有一螢光試劑。
    [8] 如申請專利範圍第7項所述之鑑定套組，其中該螢光試劑係為HEX、FAM、或NED。
    [9] 一種蝴蝶蘭品種之鑑定方法，包括下列步驟：(A)　提供一待檢測蝴蝶蘭之組織樣品，並萃取該組織樣品中之基因組DNA；(B)　以至少一微衛星引子對檢測該組織樣品中之基因組DNA，以取得該待檢測蝴蝶蘭之基因型，其中每一該微衛星引子對係包括：一與選自由下列群組之引子對之所示序列具有75-100%一致性之核苷酸：一包括如SEQ ID NO: 1、及SEQ ID NO: 2所示序列之第一引子對；一包括如SEQ ID NO: 3、及SEQ ID NO: 4所示序列之第二引子對；一包括如SEQ ID NO: 5、及SEQ ID NO: 6所示序列之第三引子對；一包括如SEQ ID NO: 7、及SEQ ID NO: 8所示序列之第四引子對；一包括如SEQ ID NO: 9、及SEQ ID NO: 10所示序列之第五引子對；一包括如SEQ ID NO: 11、及SEQ ID NO: 12所示序列之第六引子對；一包括如SEQ ID NO: 13、及SEQ ID NO: 14所示序列之第七引子對；一包括如SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16所示序列之第八引子對；一包括如SEQ ID NO: 17、及SEQ ID NO: 18所示序列之第九引子對；一包括如SEQ ID NO: 19、及SEQ ID NO: 20所示序列之第十引子對；一包括如SEQ ID NO: 21、及SEQ ID NO: 22所示序列之第十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 23、及SEQ ID NO: 24所示序列之第十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 25、及SEQ ID NO: 26所示序列之第十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 27、及SEQ ID NO: 28所示序列之第十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 29、及SEQ ID NO: 30所示序列之第十五引子對；一包括如SEQ ID NO: 31、及SEQ ID NO: 32所示序列之第十六引子對；一包括如SEQ ID NO: 33、及SEQ ID NO: 34所示序列之第十七引子對；一包括如SEQ ID NO: 35、及SEQ ID NO: 36所示序列之第十八引子對；一包括如SEQ ID NO: 37、及SEQ ID NO: 38所示序列之第十九引子對；一包括如SEQ ID NO: 39、及SEQ ID NO: 40所示序列之第二十引子對；一包括如SEQ ID NO: 41、及SEQ ID NO: 42所示序列之第二十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 43、及SEQ ID NO: 44所示序列之第二十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 45、及SEQ ID NO: 46所示序列之第二十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 47、及SEQ ID NO: 48所示序列之第二十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 49、及SEQ ID NO: 50所示序列之第二十五引子對；一包括如SEQ ID NO: 51、及SEQ ID NO: 52所示序列之第二十六引子對；一包括如SEQ ID NO: 53、及SEQ ID NO: 54所示序列之第二十七引子對；一包括如SEQ ID NO: 55、及SEQ ID NO: 56所示序列之第二十八引子對；一包括如SEQ ID NO: 57、及SEQ ID NO: 58所示序列之第二十九引子對；一包括如SEQ ID NO: 59、及SEQ ID NO: 60所示序列之第三十引子對；一包括如SEQ ID NO: 61、及SEQ ID NO: 62所示序列之第三十一引子對；一包括如SEQ ID NO: 63、及SEQ ID NO: 64所示序列之第三十二引子對；一包括如SEQ ID NO: 65、及SEQ ID NO: 66所示序列之第三十三引子對；一包括如SEQ ID NO: 67、及SEQ ID NO: 68所示序列之第三十四引子對；一包括如SEQ ID NO: 69、及SEQ ID NO: 70所示序列之第三十五引子對；以及一包括如SEQ ID NO: 71、及SEQ ID NO: 72所示序列之第三十六引子對；以及(C)　將所取得之該待檢測蝴蝶蘭之基因型與一已知之蝴蝶蘭基因型資料庫比對，以鑑定出該待檢測蝴蝶蘭之品種。
    [10] 如申請專利範圍第9項所述之鑑定方法，其中每一該微衛星引子對為一套引子對序列，該引子對序列係包括：一選自由該第一引子對至該第三十六引子對所組成之群組之核苷酸序列。
    [11] 如申請專利範圍第9項所述之鑑定方法，其中每一該微衛星引子對為一套引子對序列，該引子對序列係選自由：該第一引子對至該第三十六引子對所組成之群組。
    [12] 如申請專利範圍第9項所述之鑑定方法，其中於步驟(B)中係透過聚合酶鏈鎖反應以至少一微衛星引子對檢測該組織樣品中之基因組DNA。
    [13] 如申請專利範圍第9項所述之鑑定方法，其中該至少一微衛星引子對係包括一微衛星正向引子、以及一微衛星反向引子。
    [14] 如申請專利範圍第13所述之鑑定方法，其中該微衛星正向引子之5端係連接有一螢光試劑。
    [15] 如申請專利範圍第14所述之鑑定方法，其中該螢光試劑係為HEX、FAM、或NED。
    [16] 如申請專利範圍第13所述之鑑定方法，其中該微衛星反向引子之5端係連接有一螢光試劑。
    [17] 如申請專利範圍第16所述之鑑定方法，其中該螢光試劑係為HEX、FAM、或NED。
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    TWI447227B|2014-08-01|
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    2018-05-01| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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